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核酸提取被用於許多分子生物化學試驗和診斷 ，是克隆 、轉化 、酶切 、體外轉錄 、擴增 、測序等試驗的第一個步驟 。然而由於細胞內存在大量蛋白質 、碳水化合物 、原始樣品中的代謝物以及其它汙染物 ，提取高質量的核酸並非易事 。現階段的層析柱核酸提取方法有 ： （重要東西一般都放在前邊的，所以先介紹最新的技術 ，大獎國際精耐特基因的殺手鐧 ！ ！ ！） 1 、一種新的層析柱技術-雙層柱技術 時間 ：2012年 人物 ：美國科學家丁少峰教授和劉強教授 事件 ： 發明了一種新的層析柱技術-雙層柱技術 ，以及基於該新雙層柱的核酸提取方法 ，用來克服常用的基於矽膠提取和基於陰離子交換提取核酸兩者的缺點 ，使核酸提取方法更加簡單 、快速 、高效 、可靠 ，特別是在血漿和尿液的液體活檢中具有非常重要的應用價值13-14 。 結構 ： 雙層柱由2種膜組成 ：第一層為陰離子交換膜二乙胺（DEAE） ，第二層為二氧化矽膜 (Fig.1) 。 原理 ： （1）樣品中的核酸結合到第一層陰離子交換膜上 ，起核酸濃縮器的作用， （2）已結合的核酸從第一層膜洗脫, 然後結合到第二層二氧化矽膜, 這是因為采用了雙功能洗脫/結合液, 也稱為耦聯液 ， （3）最終使用低鹽緩衝液將遊離核酸從第二層膜洗脫 ，獲得目的產物 (Fig.2) 。 優點: （1）特別適用於分離和純化含有極度稀釋的大容量的核酸樣品 ，例如10mL血漿或50mL尿液 ； （2）遊離的小片段DNA（80～250bp）回收率高,可比常規矽膠提取法高出4倍, 適用於血漿及尿液遊離核酸的提取 ； （3）不需要蛋白酶處理 ； （4）提供更高純度和更少抑製劑的核酸樣品 ； （5）洗脫的核酸可直接用於下遊應用, 包括焦磷酸化激活的聚合反應（Pyrophosphorolysis Activated Polymerization ，PAP）和聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction ，PCR） 、及二代測序等 ； （6）此外 ，本方法快速 、簡便 ，無需接觸苯酚及氯仿等毒性強烈的有機溶劑 ，無需複雜繁瑣的實驗操作 ，操作全程可在短時間內完成 。 以下為常用的兩種方法 。 2 、 矽膠為基礎的提取方法 時間 ：1979年 人物 ：美國科學家Vogelstein教授和 Gillespie教授 事件 ：發表了一項以矽膠或二氧化矽為基礎的提取方法1 。 材料 ： 微孔玻璃 ，嵌入二氧化矽顆粒的濾膜，矽膠顆粒 ，二氧化矽構成的藻土型樹脂 ，和玻璃纖維 步驟 ： （1）在高濃度離液鹽的存在下 ，DNA或RNA會粘結到矽膠樹脂或膜的表麵 ，其它汙染被衝洗走 ， （2）然後用水或低鹽緩衝液洗脫DNA或RNA ，現在已成為一種流行的核酸提取方法1-6 。 原理 ： （1）在高濃度的離液鹽 ，例如碘化鈉（NaI） ，高氯酸鈉（NaCIO4） ，鹽酸胍（GuHCl）, 和異硫氰酸胍（GuTC）等的條件下 ，帶負電荷的DNA 骨架與帶正電的矽膠表麵具有高度的親和力 。 （2）現階段已對離子強度 、溫度 、pH值 、DNA大小和構象與核酸結合到矽膠表麵上的影響進行了研究 ，例如 ，矽膠表麵的結合能力與離液鹽濃度是呈線性相關的 。在一個給定的離液鹽濃度下 ，pH值越低則所有類型的DNA與矽膠表麵的結合能力越高7 。 （3）常用的將核酸與矽膠表麵粘結的試劑 ：異硫氰酸胍（GuTC） 、鹽酸胍（GuHCl） 、碘化鈉（NaI） 、高氯酸鈉（NaCIO4） 。條件控製為 ：在乙醇或異丙醇的條件下, 以及控製結合試劑PH值為6至7.5條件下 ，其結合效率顯著改善 。 應用 ： 這種層析柱常用矽膠樹脂或膜作為固定相 ，並常用離心或真空來驅動,例如 ： Promega公司的PureYield質粒小量提取係統 WizardPlus小量DNA製備純化係統 Qiagen 公司的QIAprep小量製備試劑盒 Bioland公司的EZgene質粒小量製備純化試劑盒 優點 ： 快速 、簡便 、有效 、所純化的DNA質量高並可以用於多種下遊應用 缺點 ： 高達3倍體積的離液鹽溶液被添加到1份體積的DNA或RNA樣品中方可達到矽膠結合DNA所需的有效離液鹽的濃度 ，因而血漿和尿液液體活檢標本的起始體積受到很大限製 。 3、陰離子交換為基礎的提取方法 步驟 ： 在低pH值及低鹽濃度下 ，DNA可與陰離子交換劑結合 ，隨即可用高pH值及高濃度的鹽溶液來洗脫DNA8-11 。 原理 ： 是基於DNA主鏈上的帶負電荷的磷酸根離子與分子表麵上帶正電的DEAE等基團之間的相互作用 ，溶液中的鹽濃度和pH值決定了是否結合或脫DNA 。 應用 ： （1）通常以微珠為基礎的陰離子交換柱多是重力流動型的 ，例如QIAGEN公司的基因組柱試劑盒 ，QIAGEN公司的樹脂由有一層二乙基氨基乙醇（DEAE）官能團的塗層 ；PALL公司的AcroSep層析柱 ，它是由弱的陰離子交換樹脂DEAE陶瓷HYPERD F微珠以及Q強陰離子交換陶瓷HYPERD F微珠組成的 。 （2）與基於微珠柱子相比 ，通常使用的為離心型或真空抽吸驅動型陰離子交換膜式柱子 ，例如Vivapure弱陰離子交換微型D膜離心柱 、Vivapure強陰離子交換Q膜離心柱 ，它們具有流速高 、成本低 、高通量的優勢12 。 優點 ： 簡單 、安全 、可靠 ， 其所製備的核酸具有相當於兩次CsCl梯度離心純化的超純度 。 缺點 ： 因為在洗脫液中含有高濃度的鹽，洗脫的核酸是不能直接使用的 ，通常需要一個額外的步驟 ，例如 ，乙醇或異丙醇沉澱以去除鹽 。 綜上所述 ，雙層柱提取技術無論是在對樣本的處理 、實驗的操作及獲得產物的質量上 ，都是優於其他兩種方法的 ！ 參考資料 ： 1. 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